Javascript hozirda brauzeringizda o‘chirib qo‘yilgan.Javascript o'chirilgan bo'lsa, ushbu veb-saytning ba'zi funktsiyalari ishlamaydi.
Xaver Fidalgo, * Per-Antuan Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepulveda, * Evgeniya Ranneva, Filipp Deprez fan bo'limi, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Kataloniya, Ispaniya * Ushbu mualliflar ushbu ish haqida ba'zi tushunchalarga ega Teng hissa foni: Gialuron kislotasi (HA) estetik maqsadlarda teri plombalarini ishlab chiqarishda ishlatiladigan tabiiy polisaxariddir.Inson to'qimalarida bir necha kunlik yarim umrga ega bo'lganligi sababli, HA asosidagi dermal plomba moddalari tanadagi umrini uzaytirish uchun kimyoviy jihatdan o'zgartiriladi.Tijoriy HA asosidagi plomba moddalaridagi eng keng tarqalgan modifikatsiya HA zanjirlarini o'zaro bog'lash uchun o'zaro bog'lovchi vosita sifatida 1,4-butandiol diglisidil efir (BDDE) dan foydalanishdir.Qoldiq yoki reaksiyaga kirishmagan BDDE toksik bo'lmagan hisoblanadi <2/million qism (ppm);shuning uchun bemor xavfsizligini ta'minlash uchun oxirgi teri plomba moddasidagi qoldiq BDDE miqdorini aniqlash kerak.Materiallar va usullar: Ushbu tadqiqot ishqoriy sharoitda BDDE va HA o'rtasidagi o'zaro bog'lanish reaktsiyasining qo'shimcha mahsulotini suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasini (LC-MS) birlashtirish orqali aniqlash va tavsiflashni tavsiflaydi.Natijalar: Turli tahlillardan so'ng, HA-BDDE gidrogelini dezinfeksiya qilish uchun ishlatiladigan ishqoriy sharoit va yuqori harorat ushbu yangi qo'shimcha mahsulot, "propilen glikolga o'xshash" birikmaning shakllanishiga yordam bergani aniqlandi.LC-MS tahlili shuni tasdiqladiki, qo'shimcha mahsulot BDDE bilan bir xil monoizotop massaga, boshqa ushlab turish vaqtiga (tR) va boshqa UV singdirish (l = 200 nm) rejimiga ega.BDDE dan farqli o'laroq, LC-MS tahlilida bir xil o'lchash sharoitida ushbu qo'shimcha mahsulot 200 nm da yuqoriroq aniqlash tezligiga ega ekanligi kuzatildi.Xulosa: Ushbu natijalar ushbu yangi birikmaning tuzilishida epoksid yo'qligini ko'rsatadi.Muhokama tijorat maqsadlarida HA-BDDE gidrogel (HA dermal plomba) ishlab chiqarishda topilgan ushbu yangi qo'shimcha mahsulot xavfini baholash uchun ochiq.Kalit so'zlar: gialuron kislotasi, HA dermal plomba, o'zaro bog'langan gialuron kislotasi, BDDE, LC-MS tahlili, BDDE qo'shimcha mahsuloti.
Gialuron kislotasiga (HA) asoslangan plomba moddalari kosmetik maqsadlarda ishlatiladigan eng keng tarqalgan va mashhur dermal plomba moddalaridir.1 Ushbu teri plomba moddasi gidrojel bo'lib, odatda >95% suv va 0,5-3% HA dan iborat bo'lib, ularga jelga o'xshash tuzilish beradi.2 HA polisakkarid va umurtqali hayvonlarning hujayradan tashqari matritsasining asosiy komponentidir.Ingredientlardan biri.U (1,4)-glyukuron kislotasi-b (1,3)-N-asetilglyukozamin (GlcNAc) glikozid bog'lari bilan bog'langan takrorlanuvchi disaxarid birliklaridan iborat.Bu disaxaridlar sxemasi barcha organizmlarda bir xil.Ba'zi oqsilga asoslangan plomba moddalari (masalan, kollagen) bilan solishtirganda, bu xususiyat HA ni yuqori biomoslashuvchan molekulaga aylantiradi.Ushbu plomba moddalari bemorning immun tizimi tomonidan tan olinishi mumkin bo'lgan aminokislotalar ketma-ketligining o'ziga xosligini ko'rsatishi mumkin.
Teri plomba moddasi sifatida foydalanilganda, HA ning asosiy cheklovi gialuronidaza deb ataladigan fermentlarning o'ziga xos oilasi mavjudligi sababli uning to'qimalarda tez aylanishidir.Hozirgacha to'qimalarda HA ning yarim yemirilish muddatini oshirish uchun HA tuzilishidagi bir nechta kimyoviy modifikatsiyalar tasvirlangan.3 Ushbu modifikatsiyalarning aksariyati HA zanjirlarini o'zaro bog'lash orqali gialuronidazaning polisakkarid polimerlariga kirishini kamaytirishga harakat qiladi.Shuning uchun, HA tuzilishi va o'zaro bog'lovchi vosita o'rtasida ko'priklar va molekulalararo kovalent bog'lanishlar hosil bo'lishi tufayli, o'zaro bog'langan HA gidrogel tabiiy HA ga qaraganda ko'proq anti-ferment degradatsiyasi mahsulotlarini ishlab chiqaradi.4-6
Hozirgacha o'zaro bog'langan HA ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan kimyoviy o'zaro bog'lash vositalariga metakrilamid, 7 gidrazid, 8 karbodiimid, 9 divinil sulfon, 1,4-butandiol diglisidil efir (BDDE) va poli (etilen glikol) diglisidil efir kiradi.10,11 BDDE hozirda eng ko'p qo'llaniladigan o'zaro bog'lash agenti hisoblanadi.Ushbu turdagi gidrogellar o'nlab yillar davomida xavfsiz ekanligi isbotlangan bo'lsa-da, ishlatiladigan o'zaro bog'lovchi moddalar sitotoksik va ba'zi hollarda mutagen bo'lishi mumkin bo'lgan reaktiv reagentlardir.12 Shuning uchun oxirgi gidrogelda ularning qoldiq miqdori yuqori bo'lishi kerak.Qoldiq konsentratsiyasi millionda 2 qismdan (ppm) kam bo'lsa, BDDE xavfsiz hisoblanadi.4
Kam qoldiqli BDDE kontsentratsiyasini, HA gidrogellarida oʻzaro bogʻlanish darajasini va oʻrnini bosish holatini aniqlashning bir necha usullari mavjud, masalan, gaz xromatografiyasi, massa spektrometriyasi (MS) bilan birgalikda oʻlchamni istisno qilish xromatografiyasi, yadro magnit-rezonans (NMR) floresansini oʻlchash usullari va Diyot massivi birlashtirilgan yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi (HPLC).13-17 Ushbu tadqiqot ishqoriy sharoitda BDDE va HA reaktsiyasi natijasida hosil bo'lgan yakuniy o'zaro bog'langan HA gidrogelidagi qo'shimcha mahsulotni aniqlash va tavsiflashni tavsiflaydi.HPLC va suyuq xromatografiya-mass-spektrometriya (LC-MS tahlili).BDDE ning ushbu qo‘shimcha mahsulotining toksikligi noma’lum bo‘lgani uchun uning qoldiq miqdorini odatda yakuniy mahsulotda BDDE da bajariladigan usulga o‘xshash tarzda aniqlashni tavsiya qilamiz.
Olingan HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Yaponiya) natriy tuzining molekulyar og'irligi ~ 1,368,000 Da (Loran usuli) 18 va ichki yopishqoqligi 2,20 m3 / kg.O'zaro bog'lanish reaktsiyasi uchun BDDE (≥95%) Sigma-Aldrich Co. (Sent-Luis, MO, AQSh) dan sotib olindi.Sigma-Aldrich kompaniyasidan pH 7,4 bo'lgan fosfat tamponli sho'r suv sotib olindi.LC-MS tahlilida ishlatiladigan barcha erituvchilar, asetonitril va suv HPLC sifatli sifatdan sotib olingan.Formik kislota (98%) reagent navi sifatida sotib olinadi.
Barcha tajribalar UPLC Acquity tizimida (Waters, Milford, MA, AQSh) amalga oshirildi va elektrosprey ionlash manbai (AB SCIEX, Framingham, MA, AQSh) bilan jihozlangan API 3000 uch quadrupole massa spektrometriga ulandi.
O'zaro bog'langan HA gidrogellarining sintezi 1% ishqor (natriy gidroksid, NaOH) ishtirokida 10% (w/w) natriy gialuronat (NaHA) eritmasiga 198 mg BDDE qo'shish orqali boshlandi.Reaksiya aralashmasidagi yakuniy BDDE kontsentratsiyasi 9,9 mg/ml (0,049 mM) edi.Keyin, reaksiya aralashmasi yaxshilab aralashtiriladi va bir hil holga keltiriladi va 45 ° C da 4 soat davom etishi uchun ruxsat etiladi.19 Reaksiyaning pH qiymati ~12 da saqlanadi.
Shundan so'ng, reaktsiya aralashmasi suv bilan yuvildi va yakuniy HA-BDDE gidrogel filtrlandi va 10 dan 25 mg / ml gacha bo'lgan HA konsentratsiyasiga va yakuniy pH 7,4 ga erishish uchun PBS buferi bilan suyultirildi.Ishlab chiqarilgan o'zaro bog'langan HA gidrogellarini sterilizatsiya qilish uchun ushbu gidrogellarning barchasi avtoklavlanadi (20 daqiqa davomida 120 ° C).Tozalangan BDDE-HA gidrogel tahlil qilinguncha 4°C da saqlanadi.
O'zaro bog'langan HA mahsulotida mavjud bo'lgan BDDEni tahlil qilish uchun 240 mg namuna tortildi va markaziy teshikka kiritildi (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, AQSh; hajmi 0,5 ml) va xona haroratida 10 000 rpm da santrifüj qilindi. 10 daqiqa.Hammasi bo'lib 20 mL tushiriladigan suyuqlik yig'ildi va tahlil qilindi.
BDDE standartini (Sigma-Aldrich Co) ishqoriy sharoitda (1%, 0,1% va 0,01% NaOH) tahlil qilish uchun, agar quyidagi shartlar bajarilsa, suyuqlik namunasi 1:10, 1:100 yoki gacha. 1:1,000,000 Agar kerak bo'lsa, tahlil qilish uchun MilliQ deionizatsiyalangan suvdan foydalaning.
O'zaro bog'lanish reaktsiyasida ishlatiladigan boshlang'ich materiallar uchun (HA 2%, H2O, 1% NaOH va 0,049 mM BDDE) ushbu materiallardan tayyorlangan har bir namunaning 1 ml dan bir xil tahlil shartlari yordamida tahlil qilindi.
Ion xaritasida paydo bo'ladigan cho'qqilarning o'ziga xosligini aniqlash uchun 20 µL namunaga 10 µL 100 ppb BDDE standart eritmasi (Sigma-Aldrich Co) qo‘shildi.Bunday holda, har bir namunadagi standartning yakuniy konsentratsiyasi 37 ppb ni tashkil qiladi.
Birinchidan, 10 mkl standart BDDE (Sigma-Aldrich Co) ni 990 mkL MilliQ suv (zichligi 1,1 g/ml) bilan suyultirish orqali 11 000 mg/L (11 000 ppm) konsentratsiyali BDDE eritmasini tayyorlang.Oraliq standart suyultirish sifatida 110 µg/L (110 ppb) BDDE eritmasini tayyorlash uchun ushbu eritmadan foydalaning.Keyin, 75, 50, 25, 10 va 1 ppb kerakli konsentratsiyaga erishish uchun oraliq suyultiruvchini bir necha marta suyultirish orqali standart egri chiziqni tayyorlash uchun oraliq BDDE standart suyultiruvchisidan (110 ppb) foydalaning.1-rasmda ko'rsatilganidek, 1,1 dan 110 ppb gacha bo'lgan BDDE standart egri chizig'i yaxshi chiziqlilikka ega (R2>0,99).Standart egri chiziq to'rtta mustaqil tajribada takrorlandi.
Shakl 1 BDDE standart kalibrlash egri chizig'i LC-MS tahlili natijasida olingan, unda yaxshi korrelyatsiya kuzatiladi (R2>0,99).
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi.
O'zaro bog'langan HAda mavjud BDDE standartlarini va asosiy yechimdagi BDDE standartlarini aniqlash va miqdorini aniqlash uchun LC-MS tahlilidan foydalanildi.
Xromatografik ajratish LUNA 2,5 mkm C18(2)-HST ustunida (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, AQSh) erishildi va tahlil davomida xona haroratida (25°C) saqlangan.Harakatlanuvchi faza asetonitril (erituvchi A) va 0,1% chumoli kislotasi bo'lgan suvdan (eritma B) iborat.Harakatlanuvchi faza gradientli elyusiya bilan chiqariladi.Gradient quyidagicha: 0 daqiqa, 2% A;1 daqiqa, 2% A;6 daqiqa, 98% A;7 daqiqa, 98% A;7,1 daqiqa, 2% A;10 daqiqa, 2% A. Ishlash vaqti 10 minut va inyeksiya hajmi 20 mkL.BDDE ni saqlash vaqti taxminan 3,48 minutni tashkil qiladi (tajribalar asosida 3,43 dan 4,14 minutgacha).Mobil faza LC-MS tahlili uchun 0,25 ml/min oqim tezligida pompalandi.
BDDE tahlili va MS tomonidan miqdorini aniqlash uchun UPLC tizimi (Suvlar) elektrosprey ionlash manbai bilan jihozlangan API 3000 uch quadrupole massa spektrometri (AB SCIEX) bilan birlashtiriladi va tahlil ijobiy ion rejimida (ESI+) amalga oshiriladi.
BDDE da o'tkazilgan ion fragment tahliliga ko'ra, eng yuqori intensivlikka ega bo'lgan fragment 129,1 Da ga mos keladigan fragment ekanligi aniqlandi (6-rasm).Shuning uchun, miqdoriy aniqlash uchun ko'p ionli monitoring rejimida (MIM) BDDE ning massa konversiyasi (massa-zaryad nisbati [m/z]) 203,3/129,1 Da.Shuningdek, u LC-MS tahlili uchun to'liq skanerlash (FS) rejimi va mahsulotni ion skanerlash (PIS) rejimidan foydalanadi.
Usulning o'ziga xosligini tekshirish uchun bo'sh namuna (dastlabki mobil faza) tahlil qilindi.203,3/129,1 Da massa konversiyasi bilan bo'sh namunada hech qanday signal aniqlanmadi.Tajribaning takrorlanishiga kelsak, 55 ppb (kalibrlash egri chizig'ining o'rtasida) 10 ta standart in'ektsiya tahlil qilindi, natijada qoldiq standart og'ish (RSD) <5% (ma'lumotlar ko'rsatilmagan).
Qoldiq BDDE tarkibi sakkiz xil avtoklavlangan BDDE o'zaro bog'langan HA gidrogellarida to'rtta mustaqil eksperimentga mos keladigan miqdori aniqlandi.“Materiallar va usullar” bo‘limida ta’riflanganidek, miqdorni aniqlash BDDE standart suyultirilishining regressiya egri chizig‘ining o‘rtacha qiymati bilan baholanadi, bu 203,3/129,1 Da BDDE massa o‘tishida aniqlangan noyob cho‘qqiga to‘g‘ri keladi, ushlab turish bilan. vaqt 3.43 dan 4.14 daqiqa kutmang.2-rasmda 10 ppb BDDE mos yozuvlar standartining xromatogramma namunasi ko'rsatilgan.1-jadval sakkiz xil gidrogelning qoldiq BDDE tarkibini umumlashtiradi.Qiymat diapazoni 1 dan 2,46 ppb gacha.Shuning uchun namunadagi qoldiq BDDE konsentratsiyasi inson foydalanishi uchun maqbuldir (<2 ppm).
2-rasm 10 ppb BDDE mos yozuvlar standartining ion xromatogrammasi (Sigma-Aldrich Co), 203.30/129.10 Da (musbat MRM rejimida) LC-MS tahlili natijasida olingan MS (m/z) oʻtish.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi;MS, massa;m/z, massa va zaryad nisbati.
Eslatma: 1-8 namunalar avtoklavlangan BDDE o'zaro bog'langan HA gidrogellaridir.Gidrojeldagi BDDE qoldiq miqdori va BDDE saqlash vaqtining eng yuqori nuqtasi ham xabar qilinadi.Va nihoyat, turli xil saqlanish vaqtlariga ega bo'lgan yangi cho'qqilarning mavjudligi ham xabar qilinadi.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;HA, gialuron kislotasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi;tR, saqlash vaqti;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;RRT, nisbiy ushlab turish vaqti.
Ajablanarlisi shundaki, LC-MS ion xromatogrammasining tahlili shuni ko'rsatdiki, tahlil qilingan barcha avtoklavlangan o'zaro bog'langan HA gidrogel namunalari asosida 2,73 dan 3,29 minutgacha qisqaroq saqlash vaqtida qo'shimcha cho'qqi bor edi.Misol uchun, 3-rasmda o'zaro bog'langan HA namunasining ion xromatogrammasi ko'rsatilgan, bu erda qo'shimcha cho'qqi taxminan 2,71 daqiqalik boshqa ushlab turish vaqtida paydo bo'ladi.Yangi kuzatilgan cho'qqi va BDDE cho'qqisi o'rtasidagi kuzatilgan nisbiy ushlab turish vaqti (RRT) 0,79 deb topildi (1-jadval).Yangi kuzatilgan cho'qqi LC-MS tahlilida ishlatiladigan C18 ustunida kamroq saqlanib qolganligini bilganimiz sababli, yangi cho'qqi BDDE ga qaraganda ko'proq qutbli birikmaga mos kelishi mumkin.
3-rasm LC-MS tomonidan olingan o'zaro bog'langan HA gidrogel namunasining ion xromatogrammasi (MRM massa konversiyasi 203,3/129,0 Da).
Qisqartmalar: HA, gialuron kislotasi;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi;RRT, nisbiy ushlab turish vaqti;tR, saqlash vaqti.
Kuzatilgan yangi cho'qqilar dastlab ishlatilgan xom ashyoda mavjud bo'lgan ifloslantiruvchi moddalar bo'lishi mumkinligini istisno qilish uchun ushbu xom ashyolar ham xuddi shu LC-MS tahlil usuli yordamida tahlil qilindi.Tahlil qilingan boshlang'ich materiallarga suv, suvda 2% NaHA, suvda 1% NaOH va o'zaro bog'lanish reaktsiyasida ishlatiladigan bir xil konsentratsiyadagi BDDE kiradi.Ishlatilgan boshlang'ich materialning ion xromatogrammasi hech qanday birikma yoki cho'qqini ko'rsatmadi va uning saqlanish vaqti kuzatilgan yangi cho'qqiga to'g'ri keladi.Bu fakt nafaqat boshlang'ich materialda tahlil qilish jarayoniga xalaqit beradigan har qanday birikmalar yoki moddalarni o'z ichiga olishi mumkinligi haqidagi fikrni rad etadi, ammo boshqa laboratoriya mahsulotlari bilan mumkin bo'lgan o'zaro kontaminatsiya belgilari yo'q.BDDE va yangi cho'qqilarning LC-MS tahlilidan so'ng olingan kontsentratsiya qiymatlari 2-jadvalda (1-4 namunalar) va ion xromatogrammasi 4-rasmda ko'rsatilgan.
Eslatma: 1-4 namunalar avtoklavlangan BDDE o'zaro bog'langan HA gidrogellarini ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan xom ashyoga mos keladi.Ushbu namunalar avtoklavlanmagan.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;HA, gialuron kislotasi;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi.
4-rasm HA va BDDE ning o'zaro bog'lanish reaktsiyasida ishlatiladigan xom ashyo namunasining LC-MS xromatogrammasiga mos keladi.
Eslatma: Bularning barchasi o'zaro bog'lanish reaktsiyasini amalga oshirish uchun ishlatiladigan bir xil konsentratsiya va nisbatda o'lchanadi.Xromatogrammada tahlil qilingan xom ashyo raqamlari quyidagilarga to'g'ri keladi: (1) suv, (2) 2% GA suvli eritma, (3) 1% NaOH suvli eritmasi.LC-MS tahlili 203.30/129.10 Da (musbat MRM rejimida) ommaviy konvertatsiya qilish uchun amalga oshiriladi.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;HA, gialuron kislotasi;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi.
Yangi cho'qqilarning shakllanishiga olib kelgan sharoitlar o'rganildi.O'zaro bog'langan HA gidrogelini ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan reaktsiya sharoitlari BDDE o'zaro bog'lovchi agentining reaktivligiga qanday ta'sir qilishini o'rganish uchun yangi cho'qqilarning (mumkin bo'lgan qo'shimcha mahsulotlar) shakllanishiga olib keladi, turli o'lchovlar o'tkazildi.Ushbu aniqlashlarda biz oxirgi BDDE o'zaro bog'lovchisini o'rganib chiqdik va tahlil qildik, u suvli muhitda NaOH ning turli konsentratsiyasi (0%, 1%, 0,1% va 0,01%), so'ngra avtoklavlash yoki avtoklavlashsiz ishlangan.Xuddi shu sharoitlarni simulyatsiya qilish uchun bakteriyalar protsedurasi o'zaro bog'langan HA gidrogelini ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan usul bilan bir xil."Materiallar va usullar" bo'limida ta'riflanganidek, namunaning ommaviy o'tishi LC-MS tomonidan 203.30 / 129.10 Da gacha tahlil qilindi.BDDE va yangi cho'qqining konsentratsiyasi hisoblab chiqiladi va natijalar 3-jadvalda ko'rsatilgan. Eritmada NaOH borligidan qat'iy nazar, avtoklavlanmagan namunalarda yangi cho'qqilar aniqlanmagan (namuna 1-4, jadval. 3).Avtoklavlangan namunalar uchun yangi cho'qqilar faqat eritmada NaOH borligida aniqlanadi va cho'qqining hosil bo'lishi eritmadagi NaOH kontsentratsiyasiga bog'liq ko'rinadi (5-8 namunalar, 3-jadval) (RRT = 0,79).5-rasmda NAOH bor yoki yo'qligida ikkita avtoklavlangan namunalar ko'rsatilgan ion xromatogrammasining namunasi ko'rsatilgan.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi.
Eslatma: Yuqori xromatogramma: Namuna 0,1% NaOH suvli eritmasi bilan ishlangan va avtoklavlangan (20 daqiqa davomida 120°C).Pastki xromatogramma: Namuna NaOH bilan ishlov berilmagan, lekin bir xil sharoitlarda avtoklavlangan.203.30/129.10 Da (musbat MRM rejimida) massa konvertatsiyasi LC-MS tomonidan tahlil qilindi.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi.
NaOH bo'lgan yoki bo'lmagan avtoklavlangan barcha namunalarda BDDE kontsentratsiyasi sezilarli darajada kamaydi (16,6 martagacha) (5-8 namunalar, 2-jadval).BDDE kontsentratsiyasining pasayishi yuqori haroratlarda suv BDDE ning epoksid halqasini ochish uchun 1,2-diol birikmasini hosil qilish uchun asos (nukleofil) bo'lishi mumkinligi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.Ushbu birikmaning monoizotop sifati BDDE dan farq qiladi va shuning uchun unga ta'sir qilmaydi.LC-MS 203.30/129.10 Da massa siljishini aniqladi.
Nihoyat, bu tajribalar shuni ko'rsatadiki, yangi cho'qqilarning paydo bo'lishi BDDE, NAOH va avtoklavlash jarayonining mavjudligiga bog'liq, ammo HA bilan hech qanday aloqasi yo'q.
Taxminan 2,71 daqiqa ushlab turish vaqtida topilgan yangi cho'qqi LC-MS bilan tavsiflangan.Shu maqsadda BDDE (9,9 mg/ml) 1% NaOH suvli eritmasida inkubatsiya qilingan va avtoklavlangan.4-jadvalda yangi cho'qqining xarakteristikalari ma'lum bo'lgan BDDE mos yozuvlar cho'qqisi bilan taqqoslanadi (ushlab turish vaqti taxminan 3,47 minut).Ikki cho'qqining ion parchalanish tahliliga asoslanib, 2,72 daqiqa ushlab turish vaqtiga ega cho'qqi BDDE cho'qqisi bilan bir xil fragmentlarni ko'rsatadi, degan xulosaga kelish mumkin, ammo har xil intensivlikdagi (6-rasm).2,72 daqiqa ushlab turish vaqtiga (PIS) to'g'ri keladigan cho'qqi uchun 147 Da massada parchalanishdan keyin yanada qizg'in cho'qqi kuzatildi.Ushbu aniqlashda foydalanilgan BDDE kontsentratsiyasida (9,9 mg/ml) ultrabinafsha spektrdagi turli absorbsiya rejimlari (UV, l=200 nm) xromatografik ajratishdan keyin ham kuzatilgan (7-rasm).Saqlash vaqti 2,71 daqiqa bo'lgan cho'qqi 200 nm da ko'rinadi, shu bilan birga BDDE cho'qqisi xromatogrammada bir xil sharoitlarda kuzatilmaydi.
4-jadval. Saqlash vaqti taxminan 2,71 daqiqa bo'lgan yangi cho'qqi va 3,47 daqiqa ushlab turish vaqti bilan BDDE cho'qqisini tavsiflash natijalari
Eslatma: Ushbu natijalarni olish uchun LC-MS va HPLC tahlillari (MRM va PIS) ikkita tepada o'tkazildi.HPLC tahlili uchun to'lqin uzunligi 200 nm bo'lgan UVni aniqlash qo'llaniladi.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;HPLC, yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasi;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi;m/z, massa va zaryad nisbati;PIS, mahsulot ionlarini skanerlash;ultrabinafsha nurlar, ultrabinafsha nurlar.
Eslatma: Massa bo'laklari LC-MS tahlili (PIS) orqali olinadi.Yuqori xromatogramma: BDDE standart namuna fragmentlarining massa spektri.Pastki xromatogramma: Yangi cho'qqining massa spektri aniqlandi (BDDE cho'qqisi bilan bog'liq RRT 0,79).BDDE 1% NaOH eritmasida qayta ishlangan va avtoklavlangan.
Qisqartmalar: BDDE, 1,4-butandiol diglisidil efir;LC-MS, suyuqlik xromatografiyasi va massa spektrometriyasi;MRM, ko'p reaktsiya monitoringi;PIS, mahsulot ionini skanerlash;RRT, nisbiy ushlab turish vaqti.
7-rasm 203,30 Da prekursor ionining ion xromatogrammasi va (A) 2,71 daqiqa ushlab turish vaqti bilan yangi cho'qqi va (B) BDDE mos yozuvlar standart cho'qqisining UV aniqlanishi 200 nm da 3,46 daqiqada.
Ishlab chiqarilgan barcha o'zaro bog'langan HA gidrogellarida LC-MS miqdorini aniqlashdan keyin qoldiq BDDE kontsentratsiyasi <2 ppm bo'lganligi kuzatildi, ammo tahlilda yangi noma'lum tepalik paydo bo'ldi.Ushbu yangi cho'qqi BDDE standart mahsulotiga mos kelmaydi.BDDE standart mahsuloti ham ijobiy MRM rejimida bir xil sifat konvertatsiyasi (MRM konvertatsiyasi 203.30/129.10 Da) tahlilidan oʻtdi.Odatda, gidrogellarda BDDE ni aniqlash uchun chegara sinovlari sifatida xromatografiya kabi boshqa analitik usullar qo'llaniladi, ammo maksimal aniqlash chegarasi (LOD) 2 ppm dan bir oz pastroqdir.Boshqa tomondan, hozirgi kunga qadar NMR va MS o'zaro bog'langan HA mahsulotlarining shakar birligi bo'laklarida HA ning o'zaro bog'lanish darajasini va / yoki modifikatsiyasini tavsiflash uchun ishlatilgan.Ushbu usullarning maqsadi hech qachon biz ushbu maqolada tasvirlangan past konsentratsiyalarda qoldiq BDDE aniqlash miqdorini aniqlash bo'lmagan (bizning LC-MS usulimizning LOD = 10 ppb).
Yuborilgan vaqt: 2021 yil 01-sentabr